蔡金艳 张锦文 唐菲 张小琼 徐江涛 张勇慧
1. 广东药学院·药科学院，广东广州510006;
2. 华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北武汉430030;
3. 华中科技大学同济医学院·药学院，湖北武汉430030;
4. 湖北省天然药物化学与资源评价重点实验室，湖北武汉430030）
摘要： 目的对金线莲Anoectochilus roxburghii （ Wall. ） Lindl. 中富含的主要成分kinsenoside 进行抗癌活性研究。方法采
用磺酰罗单明Sulforhodamine B （ SRB） 法和MTT 分析法。结果对3 种敏感细胞株： 人白血病细胞株（ HL － 60 ） 、人肺癌
细胞株（ A － 549） 、人肝癌细胞株（ BEL － 7402） 筛选结果10 － 5mmol /L 的化合物kinsenoside 时抑制率均小于85%，评定
为无效。结论化合物kinsenoside 的抗癌活性不显著。
关键词： 金线莲； kinsenoside; 抗癌
DOI 标识： doi: 10. 3969 /j. issn. 1008-0805. 2010. 10. 011
中图分类号： R962 文献标识码： A 文章编号： 1008-0805（ 2010） 10-2444-02
金线莲（ Herba Anoectochili） 为兰科开唇兰属植物花叶开唇兰Anoectochilus roxburghii（ Wall. ）Lindl. 的干燥全草，是多年生珍稀中草药，有清凉解毒、滋阴降火、消炎止痛之功效，可用于治疗肺结核咯血、糖尿病、肾炎、膀胱炎、重症肌无力、遗精、风湿性及类风湿性关节炎、小儿惊风、妇女白带以及毒蛇咬伤等症； 生于山地林下阴湿地，在我国分布于浙江、福建、台湾、江西、西藏等省区［1］，俗称“金草”“神药”“药王”“乌人参”等。化学成分方面除发现金线莲中氨基酸，微量元素及糖类的含量高外，还有黄酮类、甾体、三萜类等化合物分离鉴定的报道［2 ～ 4］。通过对野生金线莲的化学成分研究，鉴定了两个丁酸苷类化合物β － D － glucopyranosyl－ （ 3R） – hydroxybutanolide （ Ⅰ，kinsenoside），methyl 4 － β － D － glucopyranosyl － butanoate（ Ⅱ） ［5］，并发现kinsenoside 含量很高。Kinsenoside 作为开唇兰属多种植物含有的主要成分，其降血糖［6］、保肝护肝［7］、降血脂［8］等活性已多有研究。本实验选取3 种敏感的肿瘤细胞株，对该化合物进行抗肿瘤活性测试。
1 材料与试剂
1. 1 肿瘤细胞株和培养基人白血病细胞株HL － 60、人肺癌细胞株A － 549、人肝癌细胞株BEL － 7402 （ 中国科学院细胞库） 培养在含10%胎牛血清（ 杭州四季青生物工程材料有限公司） 的RPMI 1640 培养基（ Gibco 公司） 中，培养条件为： 37℃，饱和湿度，5% CO2的培养环境。
1. 2 试剂3 － （ 4，5 － dimethylthiazol － 2 － yl）－ 2，5－ diphenyl tetrazolium bromide（ MTT） （ Sigma公司） 溶解在过滤除菌的1 × PBS （ pH 值7. 4，NaCl 0. 8%，KCl 0. 02%，Na2HPO40. 144%，KH2 PO4 0. 024% ） ，终浓度0. 5 mg /ml; SRB （ 美国Sigma 公司） 溶解在1% 的乙酸，终浓度4 mg /ml; SDS（ 北京鼎国生物技术发展有限公司） 溶解在10 mmol /L 的盐酸中，终浓度为10%; 注射用盐酸阿霉素（ Adriamycin，ADM） 购自浙江海正药业股份有限公司。
受试药kinsenoside 纯度经鉴定在98% 以上； 金线莲药材由福建省漳州市南靖县和溪镇供销社提供，由中国科学院武汉植物研究所王映明教授鉴定。
2 方法
2. 1 MTT 比色法体外抗肿瘤药物筛选取处于指数增长期细胞种在96 孔板里（ 细胞浓度为20 000 个/ml， 100 μl /孔） ，培养24 h 使细胞贴壁，去除上清，加200 μl /孔带药新鲜培养基：化合物事先溶解在DMSO 或者生理盐水里，当测试时用完全培养基稀释成所需浓度，注意DMSO 终浓度不能超过0. 1%。每个浓度设6个复孔，并设空白对照孔（ 只加培养基） 和阴性对照，同样设6 个复孔。培养实验要求时间，去除上清，加100 μl /孔浓度0. 5 mg /ml 的MTT。培养4 h 后再补加100 μl /孔的10%的SDS。37℃下10 h 后取出，微震荡5 min，放置室温下30 min，在A570nm 波长下测OD 值，并计算抑制率。
抑制率（ %） =对照组OD 值－ 测试组OD 值对照组OD 值× 100%
2. 2 SRB 法体外抗肿瘤药物筛选取处于指数增长期细胞种在96 孔板里（ 细胞浓
度为20 000 个/ml， 100 μl /孔） ，培养24 h 使细胞贴壁，去除上清，加200 μl /孔带药新鲜培养基： 化合物事先溶解在DMSO 或者生理盐水里，当测试时用完全培养基稀释成所需浓度，注意DMSO 终浓度不能超过0. 1%。每个浓度设6 个复孔，并设空白对照孔（ 只加培养基） 和阴性对照，同样设6 个复孔。继续培养至试验设计时间，终止培养，去除上清，每孔加10% TCA 200 μl，4℃条件固定l h。用二次蒸馏水
冲洗5 遍，自然晾干后每孔加入4 mg /ml SRB 溶液，室温下染色15 min，弃上清，用1%乙酸冲洗5 遍以去除非特异性结合的染料。每孔加入100 μl 10 mmol /L Tris溶液，在A515nm 波长下测OD 值，并计算抑制率（ 计算方法同MTT 比色法） 。
3 结果
见表1 ～ 2。
4 讨论
从上述的测试结果来看，化合物kinsenoside 对敏感细胞株初筛的细胞毒活性不明显，不再进行其他细胞株的复筛。本研究将化学与药理方面有机结合起来，对金线莲中富含［8］的主要成分kinsenoside在抗肿瘤方面的药理活性进行了测试，为全面评价活性化合物kinsenoside的药理作用和药用价值提供了科学依据。王常青等［9］初步研究表明，金线莲多糖对癌细胞具有较好的杀伤作用。
参考文献：
